This dissertation has been submitted by a student. This is not an example of the work written by our professional dissertation writers.

Hoofdstuk 1: Inleiding

Om als organisme te kunnen groeien is er celdeling nodig. Deze celdeling wordt gereguleerd door middel van de celcyclus en zal hier kort uitlegd worden. De celcyclus is in twee delen opgedeeld. De interfase en de M-fase. Tijdens de interfase groeit de cel en verdubbelt het zijn chromosomen. De interfase is ook weer opgedeeld in 3 delen, Gap fase 1 (G1), Synthese (S) en Gap fase 2 (G2) (zie figuur 1). In de G1 groeit de cel en bereidt het zich voor op de S-fase. In de S-fase wordt het genoom verdubbeld waarna het naar de G2 fase gaat waar de cel verder gaat met groeien tot het klaar is om te delen. Na de interfase komt de mitose of M-fase waar de cel uiteindelijk een nucleaire deling en en cytoplasmatische deling ondergaat. Wanneer de M-fase is afgerond zijn er twee cellen ontstaan die weer de celcyclus kunnen ingaan vanaf de G1 fase.

Afhankelijk van de omgevings- en ontwikkelingssignalen kunnen cellen in G1 tijdelijk of permanent de celcyclus verlaten. De cellen komen dan in een rust fase van de celcyclus waar de cellen niet delen. Deze fase wordt ook wel de G0 genoemd. De meeste cellen in het lichaam van een volwassen vertebraat delen weinig en bevinden zich het grootste deel van de tijd in de G0 fase. Wanneer een cel uit de celcyclus gaat naar de G0 fase wordt dit meestal cel cyclus exit genoemd.

Er zijn drie soorten van tijdelijke of definitieve rust fase na cel cyclus exit te onderscheiden. De eerste is quiescence, een niet delende conditie waarin de cel terug kan keren naar de celcyclus. Quiescence komt vaak voor bij cellen met DNA schade of cellen die niet de juiste benodigdheden voor proliferatie hebben. Wanneer DNA uit de cel beschadigd is maar niet te repareren is zal deze vaak in apoptose, celdood, gaan. Een tweede is terminale differentiatie, waarin de cel zich blijvend in een postmitotische staat bevind. De derde vorm van G0 fase is proliferatieve senescence, een andere vorm van permanente posmitotische staat.

De beslissing van een cel om te delen wordt gemaakt in de G1-fase. Deze beslissing wordt gemaakt na afwezigheid van verwarring, schade, of stres in de cel, volgens een zeer gecoördineerd maar automatisch proces. [sherr '99] Het punt waarop deze beslissing wordt gemaakt is een "checkpoint" die hier restrictiepunt wordt genoemd. Intracellulaire en extracellulaire signalen kunnen de celcyclus op deze checkpoints blokkeren. Wanneer er daarna weer goede condities aanwezig zijn, zoals voldoende nutriënten en groeifactoren en er geen inhibitie factoren zijn, zal een cel in quiescente staat terug de celcyclus in gaan. Er zijn meerdere checkpoints in de celcyclus aanwezig. Zo is er aan het einde van de G2 fase een checkpoint voor controle of de omgevings condities nog steeds voordelig zijn en al het DNA verdubbeld is en is er een checkpoint aan het einde van de M fase of alle chromosomen wel aan de spoel gehecht zijn voordat de cel gaat delen. Wanneer een cel gaat delen moeten beide van de chromatide van een chromosoom namelijk eerst aan de spoelen aan weerzijden van de cel gehecht zijn. De chromosomen kunnen hierdoor gelijk gesplitst worden doordat ze uit elkaar worden getrokken richting beide polen. Dit levert twee gelijkwaardige cellen op. In dit essay zijn de laatste twee checkpoints verder niet van belang.

De gehele celcyclus wordt gereguleerd door de activatie of inactivatie van verschillende cycline-afhankelijke kinasen (Cyclin-Dependent Kinases, CDKs). CDKs zijn kleine eiwit kinasen die associatie met een cycline subunit nodig hebben voor activatie [vd Heuvel '05]. Bij elke fase van de celcyclus zijn verschillende cycline/CDK complexen actief en de regulatie van de activiteit wordt geregeld via de cyclines. Tijdens elke cel cyclus ondergaan cyclines een cyclus van synthese waarna de CDKs complexen vormen met passende cyclines om vervolgens afgebroken te worden. De CDK-cycline complexen katalyseren de aanhechting van een fosfaat groep aan specifieke serine of threonine aminozuren in een doel eiwit. De fosfaat groepen veranderen eigenschappen van de doel eiwitten, zoals de interactie met andere eiwitten. CDKs worden daarom ook wel serine/threonine kinasen genoemd.

De G1 wordt gereguleerd door meerdere cyclines waaronder Cycline D1, D2, D3 en E. De belangrijkste G1 CDKs zijn CDK4 en CDK6, die aan de D-type cyclines binden, en CDK2, die voornamelijk aan cycline E en cycline A bind [Sherr '04]. In figuur 2 wordt een overzicht gegeven van de cyclines en CDKs die tijdens de celcyclus een rol spelen. Omdat er in dit essay vooral wordt gekeken naar de exit van de celcyclus tijdens de G1 en S fase worden de andere cyclines en CDKs niet besproken.

Ontregeling van de celcyclus speelt een grote rol in de ontwikkeling van kankercellen. Overexpressie van eiwitten die de celcyclus progressie regelen zoals CDKs en cyclines, en remming van eiwitten die de celcyclus stoppen kan leiden tot ongecontroleerde cel proliferatie. In menselijke tumoren zijn vooral de genen die coderen voor eiwitten die de overgang van G1 naar de S fase regelen veranderd.

Het begrijpen van de gehele celcyclus en daarmee ook vooral het gedeelte van de celcyclus exit is daarom erg belangrijk. Organismen moeten genoeg cellen kunnen vormen door deling maar wanneer ze niet bijtijds stoppen met delen kan dit leiden tot kankercellen. Kanker onderzoek richt zich dan ook vaak op het uitschakelen van de celcyclus regulatie. Dit proces is eveneens belangrijk in de regeneratie van cellen voor onderzoek naar degeneratie ziektes, waarbij bepaalde type cellen hun functie verliezen of verloren gaan. In regeneratie onderzoek wordt er op twee manieren geprobeerd de weefsels weer functionele cellen te geven. Zo wordt er onderzoek gedaan om de cellen terug te brengen naar de staat waarin ze nog niet ge-dedifferentieerd zijn maar wel weer delen. Een tweede onderzoek is gebaseerd op cel herprogrammering waarbij de cellen volledig worden ge-dedifferentieerd. Het probleem hierbij is dat ze wel tijdig moeten stoppen met delen om geen kankervorming te krijgen. Het begrijpen hoe een cel de celcyclus uitgaat is dus voor veel onderzoeken van belang.

Om de celcyclus exit verder te begrijpen staat daarom in dit essay de vraag "wat zijn de regulatie mechanismen van de celcyclus exit?" centraal. Deze vraag zal worden uitgelicht door gebruik te maken van eerder gepubliceerde artikelen en zal om nader uitgelegde redenen vooral bekeken worden in het modelorganisme Drosophila melanogaster.

Hoofdstuk 2: de celcyclus exit bepalende componenten

modelorganisme

Om een duidelijk beeld van de regulatie mechanismen van de celcyclus exit te krijgen is er hier gekozen om dit te bekijken in het modelorganisme Drosophila melanogaster. Dit omdat D. melanogaster een veel voorkomend modelorganisme in de genetica is. Het genoom is bekend en veel van de genen zijn al beschreven. Het heeft een snelle reproductie tijd waardoor er snel nakomelingen geproduceerd kunnen worden en er snel over veel organismen te beschikken is. Hiernaast is D. melanogaster erg klein en heeft het weinig voedingsstoffen en geen ingewikkelde leefomstandigheden nodig om te overleven. Dit maakt D. melanogaster een handig dier om in het laboratorium mee te werken. Naast deze voordelen is dit modeldier ook gemakkelijk in in vivo systemen te gebruiken. De meest belangrijke reden waarom D. melanogaster hier gebruikt wordt als model organisme is dat het dezelfde componenten in de celcyclus exit heeft als zoogdieren maar minder varianten van deze componenten heeft waardoor het systeem gemakkelijker te bestuderen is. Aan het einde van dit hoofdstuk zal er een vergelijking met andere modelorganismen gemaakt worden.

Retinoblastoma eiwit familie

Een van de belangrijkste componenten in de celcyclus exit wordt gecodeerd door het retinoblastoma gen. Het retinoblastoma gen is het eerste tumor onderdrukkende gen dat is geïdentificeerd en werd gevonden in 1986. Het gen was eerder gekloneerd als resultaat van een zeldzame oog tumor bij kinderen, retinoblastoma kanker. Waarom deze oog tumor ontstaat door een gen die zich in het hele lichaam bevind is niet bekend. Het retinoblastoma gen codeert voor een aminozuur fosfoproteïne, het Rb eiwit. Het Rb eiwit is een tumor onderdrukkend eiwit en is defect in de meeste vormen van kanker. Rb remt cellen in de G1 fase naar de S fase te gaan tot dat de cel klaar is om te delen[Harbour '00] (zie figuur 3). Buitensporige cel groei wordt hierdoor tegen gegaan. Er kan hierdoor gezegd worden dat Rb een negatieve regulatie op de cel cyclus heeft en daardoor de cel cyclus exit stimuleert.

Rb heeft meerdere functionele delen die samen de centrale pocket van het eiwit vormen. Rb behoort daarom tot de pocket eiwitten. Het bestaat uit twee geconserveerde delen, een A en B domein (zie figuur 4), die verantwoordelijk zijn voor de meeste eiwit-eiwit interacties. D. melanogaster bevat twee RB familie leden, RBF en RBF2. RBF2 is echter niet een essentieel gen. Rbf2 mutant vliegen vertonen namelijk geen duidelijk fenotypen [Stevaux '05]. Hier in tegen, voldoet RBF aan alle cel cyclus gerelateerde functies van een Rb eiwit familie in Drosophila.

De regulatie van RBF op een cel om te stoppen in G1 of door te gaan naar de S fase wordt gereguleerd door cycline/cdk complexen. Een van de belangrijkste taken van deze complexen is het fosforyleren en defosforyleren van RBF tijdens de celcyclus. De RBF eiwit familie bevat hiervoor meerdere fosforylatie punten die gefosforyleerd kunnen worden. Bij de G1 fase zijn het de cyclineD/cdk4 complexen en bij de G1/S fase zijn het de cyclineE/cdk2 en cyclineA/cdk2 complexen die RBF fosforyleren. De hyper-gefosforyleerde vorm, wat de inactieve vorm is, is dominant in prolifererende cellen. De hypogefosryleerde vorm, wat de actieve vorm is, komt meestal voor in quiescente cellen of differentiërende cellen. [Du '06]

E2F transcriptie factoren

De biologische functie van RBF bestaat uit tumor onderdrukking, regulatie van de cel cyclus, differentiatie en apoptose. Deze functies van RBF worden allemaal gereguleerd in combinatie met een heleboel cellulaire eiwitten. Een van die eiwitten die interactie met RBF aangaat is E2F.

In de begin dagen stond E2F bekend als DRTF1/E2F. E2F was ontdekt als een cellulaire factor nodig voor de vroege regio 1A (E1A)-transformatie eiwit van het adenovirus om de transcriptie activatie van een viraal E2A promoter te reguleren [Nevins '92]. DRTF1 was eerder geïdentificeerd als een transcriptie factor waarvan de DNA bindings activiteit verlaagd werd tijdens de differentiatie van F9 embryonale carcinoma stam cellen [la Thangue '87]. De consensus DNA bindings site voor DRTF1 en E2F waren gelijk net als andere observaties. Dit suggereerde dat DRTF1 en E2F verwant waren. Interesse in E2F nam toe doordat, door studies van cellulaire targets van virale oncoproteïnes, het ontdekt was dat E2F belangrijk was voor de functie van RBF [Nevins '92].

E2F behoort tot de E2F familie van DNA-bindende transcriptie factoren. De meeste E2F eiwitten worden geassocieerd met een dimerisatie partner (DP) eiwit en vormen een heterodimeer complex dat aan DNA bind in een sequentie specifieke manier. Beide E2Fs en dDP hebben hiervoor een DNA-bindings domein (DBD) en een dimerisatie domein (Dim) (zie figuur 5). De D. melanogaster E2F familie leden kunnen in tweeën worden gesplitst. dE2F1 functioneert voornamelijk als een transcriptie activator en dE2F2 functioneert voornamelijk als een actieve onderdrukker van transcriptie.

Cel cyclus exit door onderdrukking van transcriptie

De cel kan door meerdere modellen van RBF-E2F in cel cyclus exit gaan. Een hiervan is het mechanismen waarbij E2F geregelde transcriptie door retinoblastoma familie leden wordt onderdrukt. Dit kan op drie manieren gebeuren. Bij de eerste manier bind RBF aan de E2F transcriptie factoren en blokkeert hiermee hun mogelijkheid tot het activeren van gentranscriptie. Cycline-cdk complexen kunnen RBF fosforyleren, zoals eerder beschreven, waardoor het E2F-DP complex vrij komt te liggen en er weer transcriptie plaats kan vinden en een cel de cel cyclus weer kan vervolgen (zie figuur 6).

Bij een tweede manier blokkeert RBF het vormen van pre-initiatie complexen waardoor aangrenzende transcriptie factoren worden onderdrukt. Bij een derde manier gebruikt RBF een eiwit interactie domein die afgescheiden is van zijn E2F-bindings plaats om geassocieerd te worden met complexen die chromatine structuren veranderen [Frolov '04]. Over deze manieren zal in het volgende hoofdstuk meer volgen.

Cdk remming

Cdk activiteit is gereguleerd door cycline afhankelijke kinase onderdrukkers (Cyclin dependent kinase inhibitors, CKIs). De Cip/Kip familie behoort tot deze CKIs. De Cip/Kip onderdrukker in D. melanogaster is Dacapo, die homoloog is aan p21/p27 van het zoogdier. De Cip/Kip moleculen zijn in staat tot het binden van alle soorten cyclines en cdks en ze daardoor inactiveren. In figuur 7 is te zien dat Dacapo eiwit, dap, cycline-cdk complexen in vitro kan remmen. Om dit te testen zijn wild-type en mutant eiwitten vergeleken in de mogelijkheid tot inhibitie van kinase activiteit van gezuiverde eiwit complexen. Bacterieel tot expressie gekomen Dacapo kon histon H1 kinase activiteit van het humaan cyclineE-cdk2 remmen. De twee mutant eiwitten met onderbrekingen in de bindings regio van cycline konden dit niet.Ook is er in ditzelfde onderzoek aangetoond dat overexpressie van dap celcyclus progressie in vivo kan remmen en dat expressie van dap gecorreleerd is met de exit van de cel cyclus [de Nooij '96].

CKIs kunnen de cyclines en cdks apart binden maar hebben meer affiniteit voor de heterodimere complexen. Hierdoor kunnen ze een regulerende functie hebben in alle fasen van de cel cyclus. Omdat cycline-cdk complexen een remmende werking op RBF hebben en CKIs een remmende werking op cycline-cdks stimuleren CKIs RBF als het ware via een negatief-negatieve pathway (zie figuur 3). CKIs zijn daarom naast RBF remmers van de cel cyclus en daarmee stimulansen van de cel cyclus exit.

APC/C

Zoals eerder besproken is cdk activiteit een belangrijke factor voor de progressie van de cel cyclus. Cdk speelt hier echter maar een rol tot de metafase. Voortgang in de anafase wordt namelijk door een ander regulatie component gereguleerd. Een ubiquitine-eiwit ligase die anafase-promoting complex (APC) of cyclosoom wordt genoemd speelt hier deze rol. Het ubiquitineert verschillende regulatie eiwitten en richt deze daarbij naar het proteasoom voor afbraak. De APC/C activiteit schommelt in reactie op veranderingen in de samenkomst van het APC met de activerende subunits Cdc20 of Cdh1 [Sullivan '07] (zie figuur 8). Associatie van het APC met Cdc20 in het middelste deel van de mitose lijdt tot de initiatie van de anafase. Associatie van het APC met Cdh1 in het late deel van de mitose onderhoudt het APC activiteit door de G1 fase. Een belangrijk doelwit van het APC is securine. Securine is normaal gehecht aan separase wat het inactief maakt. Wanneer securine wordt afgebroken komt separase vrij en initieert het chromosoom splitsing. Het APC ubiquitineert ook mitotische cycline. De afbraak van deze cyclines inactiveert de cdks en staat fosfatases toe om de cdk substraten in de cel te defosforyleren. Defosforylatie van cdk substraten is nodig voor normale chromosoom en spoel beweging in de anafase zoals in eerder beschreven. Het is ook belangrijk voor de gebeurtenissen die hierop volgen in de telofase waarin de spoel uiteen valt, de kern opnieuw wordt gevormd en het chromatine wordt gedecondenseert [Sullivan '07]. De laatste delen van de mitose worden dus gereguleerd door defosforylatie van cdk substraten en ubiquitinatie van APC substraten.

APC/C heeft hiernaast ook een rol in de cel cyclus blokkades die lijden tot quiescence. Ook Skp-Cullin-F-box (SCF) ubiquitine ligase complexen spelen hier een rol in [Buttita '07]. Naast de eerder genoemde degradaties van substraten in de mitose heeft APC/C ook een degraderende rol voor Skp2. De degradatie van de degradatie machine is gekoppeld aan de cel cyclus exit pathway. Hypogefosforyleert RBF kan namelijk worden geassocieerd met het APC/C, voornamelijk wanneer het geactiveerd wordt door Cdh1 [Binne '07]. Dit stimuleert degradatie van Skp2, een component van het SCFskp2 complex die verantwoordelijk is voor degradatie van p27 en p21. De RBF/APC/C interactie resulteert dus in de tot stand houding van p27 en p21. RBF kan hierdoor in een tweede, E2F onafhankelijke manier, de cel cyclus tegen houden (zie figuur 3) [Buttita '07]. Wanneer een gemuteerd RBF wordt genomen, die niet aan Cdh1 kan binden, kan gedemonstreerd worden dat de RBF/APC/C interactie nodig is voor RBF om de cel cyclus in prolifererende cellen tegen te houden [Binne '07]. Uit verschillende APC/C en SCF mutant studies in vivo is echter gebleken dat de cel cyclus maar tijdelijk wordt vertraagd. Dit wijst erop dat de eiwit degradatie machine en rol speelt in de cel cyclus exit maar dat er meerdere mechanismen nodig zijn om uiteindelijk een cel cyclus exit te krijgen [Buttita '07].

Prospero

Het laatste component die een rol speelt in de cel cyclus exit is prospero (Pros) (zie figuur 3). Pros is een homeobox transcriptie factor die naast cel cyclus exit ook terminale differentiatie coördineert. In neuroblasten is Pros asymmetrisch gelokaliseerd op het cytoplasmisch membraan. Tijdens het delen van de cel wordt Pros geërfd door één dochter cel, de ganglion moeder cel (GMC). Hier zal Pros de nucleus ingaan en terminale differentiatie aansporen. In meerdere studies van Pros in het Drosophila embryo werd er aangetoond dat Pros de transcriptie van cycline E en String tegenhield [Li '00]. Het bleef echter onduidelijk of dit een indirect effect van Pros was op differentiatie of een meer direct effect op deze cel cyclus genen [Buttita '07]. Uit later onderzoek waarin de genoom-wijde binding van Pros op chromatine werd onderzocht bleek dat Pros een directe rol had in het transcriptioneel tegen houden van meerdere sleutel cel cyclus genen waaronder, naast cycline E en string, ook e2f1. Pros heeft hiernaast ook een directe rol in het activeren van een aantal terminale differentiatie genen in neuronen wat het een dubbel functioneel signaal maakt [Choksi '06].

Pros expressie wordt in bepaalde type cellen erg onderdrukt. Hierdoor is het niet waarschijnlijk dat Pros een universele rol in de cel cyclus exit speelt. Uit onderzoek in de darmen van Drosophila is een stam cel differentiatie pathway gevonden waarin eenzelfde asymmetrisch delings patroon is gevonden gevolgd door differentiatie zonder tussen komst van mitose. Pros komt precies tot uiting in een van de resulterende postmitotische cel types waar het waarschijnlijk de terminale differentiatie van de celcyclus exit coördineert. Andere Homeobox eiwitten zouden eenzelfde rol kunnen spelen in andere cel types. Er blijft daarom nog veel onderzoek naar dubbel-functionele transcriptie factoren [Buttita '07].

Celcyclus regulatie van C. elegans en zoogdieren

Twee andere model organismen waarin er veel onderzoek is gedaan naar de celcyclus exit zijn Caenorhabditis elegans en zoogdieren. Het voornaamste verschil tussen deze model organismen is het verschil in Rb en E2F-familie leden (zie tabel 1). Het zoogdier heeft namelijk acht E2F familie leden (E2f1-E2F8) en drie Rb familie leden (pRb, p107 en p130) waar D. melanogaster er van beide families maar twee heeft en C. elegans er drie E2F familie leden (Efl-1, Efl-2 en F49E12.6) en slechts één Rb familie lid (Lin-35) heeft.

In het zoogdier is de verdeling van de E2F familie leden hetzelfde als in D. melanogaste (zie figuur 9). De E2F familie is opgedeeld in activatoren (E2F1-E2F3a) en onderdrukkers (E2F3b-E2F8). E2F1-E2F6 bevatten net als dE2F-1 en dE2F-2 van D. melanogaster dimerisatie domeinen en vormen DNA-bindings heterodimeren met eiwitten van de differentiatie-regulatie transcriptie factor-1 polypeptide (DP) familie. E2F6 vormt complexen met polycomb-groep (PcG) eiwitten. E2F7 en E2F8 hebben deze DP-bindings domeinen niet maar bevatten tandem repeats van een E2F DNA-bindings domein. E2F1-E2F5 bevatten C-terminale domeinden waarmee ze interactie aangaan met de pocket domeinen van de Rb familie leden. De drie familie leden associëren met verschillende E2F eiwitten. Zo heeft pRB de voorkeur voor E2F1-E2F3a en E2F3b-E2F5 en hebben p107 en p130 de voorkeur voor associatie met E2F3b-E2F5. De pRB familie leden van zoogdieren worden net als die van D. melanogaster gereguleerd door fosforylatie van cycline-cdk complexen. [vd Heuvel '08]

Het C. elegans eiwit product van het Rb gen gerelateerde gen cell lineage-abnormal-35 (lin-35) vertoont de meeste homologie met p107 en p130. Het C. elegans gen bevat één DP-achtig gen, dpl-1. Van de drie potentiële homologen aan de zoogdier E2F transcriptie factoren (E2F-like-1 (efl-1), efl-2 en F49E12.6) is efl-1 het enige E2F gerelateerde gen met een duidelijk loss-of-function fenotype. De fenotypes van efl-1, dpl-1 en lin-35 mutanten hebben veel overeenkomsten en hun producten functioneren waarschijnlijk in een co-onderdrukkings complex. [vd Heuvel '08]

Naast de verschillen in Rb en E2F familie leden zijn er ook verschillen in cycline afhankelijke kinase remmers, CKIs (zie tabel 1). Zoogdieren hebben net als D. melanogaster Cip/Kip type CKIs. Ze hebben drie verschillende eiwitten van deze familie, p21Cip1, p27Kip1 en p57Kip2. Naast de Cip/Kip type CKIs hebben zoogdieren ook nog Ink4 type CKIs. Deze Ink4 type CKIs familie bevat vier leden, p15, p16, p18 en p19, vernoemd naar hun moleculaire omvang. Ink4 remmers binden, in tegen stelling tot Cip/Kip type CKIs die aan alle cdks en cyclines binden, alleen aan cdk4 en cdk6 waardoor ze associatie met D cyclines voorkomen [Pajalunga '07].

C. elegans heeft twee CKI familie leden, CKI-1 en CKI-2. Beide eiwitten lijken erg op de Cip/Kip types p21 en p27 in de aminozuur sequentie maar alleen CKI-1 functioneert op dezelfde wijze in de celcyclus.[vd Heuvel '05]

In deze vergelijkingen is te zien dat D. melanogaster meer op het zoogdier lijkt op het niveau van regulatie van de celcyclus dan C. elegans. Ook is op te merken dat het zoogdier door zijn vele leden van de Rb, E2F transcriptie factor en CKI families veel complexer is dan D. melanogaster wat deze vlieg tot een geschikt model organisme maakt in onderzoek naar de celcyclus exit.

Hoofdstuk 3: regulatie van de celcyclus exit componenten

Welke componenten de cel cyclus exit bepalen is grotendeels bekend (weergegeven in figuur 3). Waar nog een heleboel vraagtekens liggen is hoe deze componenten op hun beurt weer worden gereguleerd. In dit hoofdstuk zal zover er tot nu toe bekend is hier een antwoord op worden gegeven. Er zal worden gekeken welke signalen er aangrijpen op de celcyclus remmende componenten RBF en CKI. Hiernaast zal er verder ingegaan worden op dE2F target genen en de regulatie hiervan.

Retinoblastoma regulatie

Zoals eerder beschreven wordt de activatie en inactivatie van RBF gereguleerd door fosforylatie. Het fosforyleren van RBF door CDKs wordt geïnhibeerd door CKIs wat zorgt voor celcyclus exit. Dit lijdt tot gehypofosforyleerde RBF die een complex vormen met dE2F en zo celcyclus gen expressie blokkeert. Een volgende vraag is dan hoe gehypofosforyleerde RBF ontstaan wanneer CKIs afwezig zijn of wanneer cycline-cdk activiteit niet daalt. Om dit uit te zoeken wordt er onderzoek gedaan naar fosfatases die werken op RBF. Uit eerder onderzoek werd Protein Phosphatase 1 (PP1) als een potentiële fosfatase geïdentificeerd. Een RBF-specifieke fosfatase, gevoelig voor concentraties van fosfatase remmer, is namelijk gevonden in mitotische extracten van cellen [Nelson '97]. Hiernaast is ook een PP1 katalytisch subunit geïsoleerd door zijn mogelijkheid om interactie aan te gaan met pRb, homoloog van RBF (zie figuur 10) [Vietri '06].

Uit latere studies in D. melanogaster bleek echter dat PP1 niet nodig is voor de regulatie van RBF [Swanhart '07]. Hoe RBF fosforylatie gereguleerd zou kunnen worden door differentiatie signalen is ook nog niet duidelijk [Buttita '07]. Deze connectie zal in de toekomst verder onderzocht moeten worden.

Chromatine remodellering

Naast de fosforylatie van RBF voor het reguleren van de celcyclus exit speelt RBF zelf een rol in chromatine remodellering wat een rol speelt bij dE2F afhankelijke gen repressie. De basis van chromatine is een nucleosoom die bestaat uit DNA gewikkeld om een histon octameer. Elke histon bevat een bolvormige regio, een histon-vouw domein en een minder gestructureerde N-terminale staart die naar buiten steekt. Deze staarten zijn het doelwit van meerdere post-translationele modificaties zoals acetylatie, ubiquitylatie, fosforylatie, methylatie en meer. Deze veranderingen spelen een rol in regulatie van gen expressie. Histonen zijn in het algemeen gehyperacetyleerd bij de promoter van actief afgeschreven genen en gehypoacetyleerd bij momenteel inactieve genen. Veel transcriptie regulators gebruiken histon acetyltransferase (HAT) en histon deacetylase (HDAC) activiteiten (zie figuur 11). Acetylatie van histon staarten maakt de DNA histon contacten losser waardoor chromatine minder compact wordt. Hierdoor kan een SWI/SNF ATP afhankelijke chromatine remodellerings complex binden en transcriptie gestimuleerd worden. Bij gedeacetyleerde chromatine is het DNA histon contact strakker en is het minder toegankelijk voor transcriptie factoren en daarmee transcriptie. Methylatie van de histonen door histon methyltransferase (HMT) complexen in combinatie met deacetylatie zorgt voor structuren waar geen transcriptie plaats vind zoals in heterochromatine. Dit zou op een mechanisme waarbij E2F afhankelijke celcyclus genen onderdrukt kunnen worden door de Rb familie in celcyclus exit kunnen duiden. Het is echter nog niet duidelijk welke associaties er functioneel relevant zijn voor onderdrukking van celcyclus genen in terminale differentiatie [Buttita '07].

dE2F kan door RBF geremd worden door gebruik van chromatine remodellerings enzymen zoals HDAC en HAT (zie figuur 12). HDAC geassocieerd met RBF-dE2F stimuleert nucleosoom vorming aan de promoter. Hierdoor wordt de toegang van het transcriptie mechanisme geblokkeerd. dE2F activiteit kan ook worden geremd door deacetylatie van het eiwit waardoor het niet meer aan het DNA kan binden. HAT activiteit geassocieerd met dE2F kan binding van dE2F aan de promoter stimuleren en het kan nucleosoom formatie juist remmen waardoor er wel transcriptie van het E2F target gen plaats zou kunnen vinden. [Harbour '00]

E2F target genen

E2F target genen werden als eerste gevonden bij onderzoek naar promoters van genen die bekend stonden om aangeschakeld te worden bij de G1/S fase overgang voor E2F bindingsplaatsen. Deze studies identificeerde E2F target genen die of celcyclus regulatoren (zoals cyclines E, A en B) of DNA replicatie factoren (zoals PCNA, dihydrofolate reductase (DHFR) en thymidine kinase) waren [Du '06].

Later zijn er meerdere evolutionair behouden complexen betrokken in de regulatie van E2F target genen gevonden. Deze complexen worden dREAM (Drosophila RBF, E2F en Myb-interacterende eiwitten) of Myb/MuvB genoemd en bevatten Rb/E2F complexen, Myb en Myb interacterende eiwitten. dREAM-Myb/MuvB is betrokken in transcriptionele onderdrukking maar bevat geen chromatine modificerende enzymen. Uit onderzoek [Korenjak '04] is gebleken dat het dREAM complex alleen bindt aan gedeacetyleerde histon H4 staarten en niet aan geacetyleerd histon H4 staarten (zie figuur 13). Dit duidt waarschijnlijk op een mechanisme waarbij dREAM acetylatie van target gen promoters voorkomt en ze in een onderdrukte staat houdt. Uit het onderzoek van Korenjak kwamen ook resultaten dat het dREAM complex nodig is om de genen arp53D, CG17142 enCG3505 (groep E genen) in S2 cellen stil te leggen. Deze genen zijn permanent onderdrukt in S2 cellen en geven een seks- of weefsel-specifiek expressie patroon. Hiernaast werd er in dit onderzoek aangetoond dat de dREAM subunits dE2F2 en Mip130/TWIT, in vivo, fysiek geassocieerd kunnen worden met deze groep E genen. Dit wijst erop dat dREAM complexen assembleren bij de genen arp53D, CG17142 enCG3505 en effect hebben op hun permanente onderdrukking in prolifererende cellen. Dit onderdrukkende effect blijkt echter specifiek te zijn voor genen die betrokken zijn in ontwikkelings- of seks-specifieke expressie patronen. Mogelijk is er een nog ander dE2F-RBF complex nodig voor de onderdrukking van celcyclus genen of onderdrukt het dREAM-Myb/MuvB complex de celcyclus controle targets onder andere condities. [Blais '07].

Regulatie van CKI

In D. melanogaster embryos wordt de celcyclus exit gekarakteriseerd door een abrupte downregulatie van Cycline E en een korte piek van Dacapo expressie. In dap mutant embryo's falen de meeste cellen in de epidermis en het perifere zenuwstelsel om op het juiste moment uit de mitotische cyclus te gaan en ondergaan een extra mitotische deling. Tijdens deze extra cyclus gaan de mutant cellen wel in mitotische rust wat erop wijst dat er meerdere mechanismen betrokken zijn in de exit van de mitotische cyclus. Waarschijnlijk functioneert downregulatie van de positieve cel cyclus regulator Cycline E in combinatie met de activatie van dap expressie voor celcyclus exit [de Nooij '00]. In figuur 14 is te zien dat in Cycline E mutant embryo's een verlaging van Dacapo is. Cycline E is dus nodig voor Dacapo expressie.

Uit eerdere onderzoeken was echter gebleken dat dap expressie geïnitieerd werd wanneer Cycline E niveaus daalde. Er waren ook resultaten dat er juist erg hoge Cycline E niveaus waren maar dat Dacapo niet geïnduceerd werd. Deze resultaten hebben tot het regulatie model in figuur 15 geleidt. Voordat de cel naar de celcyclus exit gaat en er precursor cellen worden ontwikkeld voorkomen ontwikkelings signalen de expressie van Dacapo ondanks de aanwezigheid van Cycline E. De remming van Dap expressie komt mogelijk door het gebrek aan essentiële transcriptie activatoren of door de activiteit van transcriptie onderdrukkers. Vlak voordat de cellen klaar zijn met delen en differentiëren worden ontwikkelingsremmers vrijgelaten en is Cycline E in staat tot het induceren van dap expressie. Dap translatie wordt gepromoot waardoor een snelle accumulatie van Dap ontstaat. Een hoge Cycline E activiteit promoot hiernaast de degradatie van Dap. Dit zorgt ervoor dat het Dap niveau snel mee daalt wanneer het Cycline E niveau weer zal gaan dalen volgens het golvende model. Dap expressie zal na het volledig dalen ven het Cycline E niveau niet meer geïnduceerd worden.

Uit de data van het onderzoek van de Nooij et al. blijkt dat Cycline E dap reguleert op transcriptioneel en post-transcriptioneel niveau. Ook blijkt uit de gegevens dat dap ook door andere signalen dan Cycline E wordt gereguleerd.

Differentiatie signalen kunnen CKIs ook transcriptioneel reguleren zodat ze cellen aanzetten om in celcyclus exit te gaan. De Cip/Kip type CKIs worden onder andere gereguleerd door basic Helix Loop Helix (bHLH) transcriptie factoren. Hiernaast zetten groei-inhibitie signalen Kip type CKI aan tot accumulatie of activatie. Deze groei-remmende cytokines zoals morfogenen van de TGF-β superfamilie en interferonen, en cel-cel contact induceren de synthese van de Cip/Kip CKIs [Mittnacht '98]. Ook condities van cellulaire stress zoals DNA schade of replicatie remming kunnen CKI synthese stimuleren. Er zijn dus meerdere factoren die de componenten van de celcyclus exit reguleren en veel hierover moet nog verder onderzocht worden.

Hoofdstuk 4: conclusie

In de laatste twintig jaar is er veel ontdekt over het mechanisme achter de celcyclus exit. Dit begon allemaal met de ontdekking van het eerste tumoronderdrukkende gen Rb. Ook E2F speelt een centrale rol in het coördineren van celcyclus progressie bij de G1 naar S fase of G0 overgang. De regulatie van specifieke target genen door Rb/E2F hangt echter niet alleen af van de aanwezigheid van specifieke Rb en E2F familie leden. Hun post-translationele modificaties en andere inter-acterende factoren spelen ook een belangrijke rol. Cyclines, cycline afhankelijke kinases en CDK inhibitoren spelen eveneens een belangrijke rol bij de celcyclus regulatie.

Ondanks dat er al veel bekend is, blijven er ook een heleboel vraagtekens over de fysiologische rollen van Rb en E2F en het specifieke actie mechanisme dat deze rollen weer aanstuurt. Modelorganismen helpen bij het onderzoeken, van deze rollen en van gen functies, in verschillende fysiologische contexten. Vragen die overblijven en meer onderzoek nodig hebben zijn bijvoorbeeld: Hoe is de RB-familie en CKI activiteit gecoördineerd in het proces van terminale differentiatie? Zijn RBs en CKIs de enige cel cyclus remmers? En hoe grijpen de signalen aan op deze en mogelijk andere cel cyclus remmers?

Een vraag die naar een ander pad van de celcyclus exit leidt is hoe de celcyclus exit behouden blijft in gedifferentieerde weefsel en niet weer gaat delen? Alleen quiescente cellen kunnen van nature de celcyclus exit verlaten en weer aan de celcyclus mee doen. Ze doen dit in de aanwezigheid van proliferatie-inducerende condities. Quiescente cellen kunnen in afwezigheid van groeifactoren geïnduceerd worden tot proliferatie door het weghalen van CKIs [Pajalunga '08]. Groeifactoren zijn dus waarschijnlijk voornamelijk nodig om de balans van positieve tegen negatieve celcyclus regulatoren te veranderen. Terminale differentiatie en senescente cellen kunnen niet van nature terug de celcyclus in gaan. Ze kunnen hier echter wel toe gestimuleerd worden. Verschillende soorten terminale differentiatie cellen kunnen door expressie van DNA-tumor-virus oncogenen, zoals SV40 LT of adenovirus E1A, gedwongen worden de celcyclus weer in te gaan [Pajalunga '08]. De verschillende groeiremmende mechanismen en moleculen hierachter zijn nog niet helemaal bekend en begrepen en er zal hier dus ook meer onderzoek naar gedaan moeten worden. Terminale differentiatie cellen kunnen ook door reactivatie van cdk4/6 kinase door overexpressie van cdk4/6 en cycline D1 weer terug de celcyclus ingaan. Ze kunnen hierbij weer skelet spier myotubes, adipocyten, enkele neuronen en cardiomyocyten vormen. Dit laat zien dat de voornaamste reden waarom terminale differentiatie cellen nooit spontaan de cel cyclus weer ingaan de negatieve controle van de cdk4/6 kinase is [Pajalunga '08]. Ook senescente cellen kunnen van nature niet terug de celcyclus in gaan. Ze kunnen wel weer geactiveerd worden en prolifereren door het weghalen van de CKIs p21 of p16 [Pajalunga '08]. In senescente cellen komt een hoog niveau van CKI complexen voor. De senescente cellen worden dus net als terminale differentiatie cellen in de celcyclus exit gehouden door hoge niveaus van remmers.

De wetenschap dat de celcyclus weer geactiveerd kan worden door het weg halen van CKIs kan een belangrijke rol spelen voor omstandigheden waar de proliferatie zwak is zoals bij weefsel repair, cel vervangingstherapie, en regeneratie. De ontdekkingen in celcyclus regulatie helpen bij het beter begrijpen van kwaadaardige cel transformatie en bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen kanker.

Het is verder moeilijk om te beantwoorden welke componenten in het mechanisme van de celcyclus er nog missen. Een compleet antwoord op de vraag wat de regulatie mechanismen van de celcyclus exit zijn is er dus nog niet. Hopelijk leidt meer onderzoek uiteindelijk tot het volledig begrijpen van dit mechanisme.

Referenties:

  • Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. Vierde editie. New York: Garland Science, Taylor and Francis group, 2002.p. 985. Fig 17-3.
  • Bardin, A. J. & Amon, A.Men and sin: what's the difference?Nat. Rev. Mol. Cell Biol.2, 815-826 (2001)
  • Binne, U. K.et al. Retinoblastoma protein and anaphase-promoting complex physically interact and functionally cooperate during cell-cycle exit.Nat. Cell Biol.9, 225-232 (2007).
  • Blais, A. & Dynlacht, B. D.E2F-associated chromatin modifiers and cell cycle control.Curr. Opin. Cell Biol.19, 658-662 (2007).
  • Buttitta, L. A. & Edgar, B. A.Mechanisms controlling cell cycle exit upon terminal differentiation.Curr. Opin. Cell Biol.19, 697-704 (2007).
  • Choksi, S. P.et al. Prospero acts as a binary switch between self-renewal and differentiation in Drosophila neural stem cells.Dev. Cell.11, 775-789 (2006).
  • de Nooij, J. C., Graber, K. H. & Hariharan, I. K.Expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor Dacapo is regulated by cyclin E.Mech. Dev.97, 73-83 (2000).
  • de Nooij, J. C., Letendre, M. A. & Hariharan, I. K.A Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor, Dacapo, Is Necessary for Timely Exit from the Cell Cycle during Drosophila Embryogenesis.Cell87, 1237-1247 (1996).
  • Du, W. & Pogoriler, J.Retinoblastoma family genes.Oncogene25, 5190-5200 (2006).
  • Frolov, M. V. & Dyson, N. J.Molecular mechanisms of E2F-dependent activation and pRB-mediated repression.J. Cell. Sci.117, 2173-2181 (2004).
  • Harbour, J. W. & Dean, D. C.The Rb/E2F pathway: expanding roles and emerging paradigms.Genes Dev.14, 2393-2409 (2000).
  • Korenjak, M.et al. Native E2F/RBF complexes contain Myb-interacting proteins and repress transcription of developmentally controlled E2F target genes.Cell119, 181-193 (2004).
  • La Thangue, N. B. & Rigby, P. W.An adenovirus E1A-like transcription factor is regulated during the differentiation of murine embryonal carcinoma stem cells.Cell49, 507-513 (1987).
  • Li, L. & Vaessin, H.Pan-neural Prospero terminates cell proliferation during Drosophila neurogenesis.Genes Dev.14, 147-151 (2000).
  • Mittnacht, S.Control of pRB phosphorylation.Curr. Opin. Genet. Dev.8, 21-27 (1998).
  • Nelson, D. A., Krucher, N. A. & Ludlow, J. W.High molecular weight protein phosphatase type 1 dephosphorylates the retinoblastoma protein.J. Biol. Chem.272, 4528-4535 (1997).
  • Nevins, J. R.E2F: a link between the Rb tumor suppressor protein and viral oncoproteins.Science258, 424-429 (1992).
  • Pajalunga, D., Mazzola, A., Franchitto, A., Puggioni, E. & Crescenzi, M.The logic and regulation of cell cycle exit and reentry.Cell Mol. Life Sci.65, 8-15 (2008).
  • Sherr, C. J. & Roberts, J. M.Living with or without cyclins and cyclin-dependent kinases.Genes Dev.18, 2699-2711 (2004).
  • Sherr, C. J. & Roberts, J. M.CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression.Genes Dev.13, 1501-1512 (1999).
  • Stevaux, O.et al. Retinoblastoma family 2 is required in vivo for the tissue-specific repression of dE2F2 target genes.Cell. Cycle4, 1272-1280 (2005).
  • Sullivan, M. & Morgan, D. O.Finishing mitosis, one step at a time.Nature Reviews Molecular Cell Biology8, 894-903 (2007).
  • Swanhart, L. M., Sanders, A. N. & Duronio, R. J.Normal regulation of Rbf1/E2f1 target genes in Drosophila type 1 protein phosphatase mutants.Developmental Dynamics236, 2567-2577 (2007).
  • Trimarchi, J. M. & Lees, J. A.Sibling rivalry in the E2F family.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.3, 11-20 (2002).
  • van den Heuvel, S.Cell-cycle regulation.WormBook, 1-16 (2005).
  • van den Heuvel, S. & Dyson, N. J.Conserved functions of the pRB and E2F families.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.9, 713-724 (2008).
  • Vietri, M., Bianchi, M., Ludlow, J. W., Mittnacht, S. & Villa-Moruzzi, E.Direct interaction between the catalytic subunit of Protein Phosphatase 1 and pRb.Cancer. Cell. Int.6, 3 (2006).

Writing Services

Essay Writing
Service

Find out how the very best essay writing service can help you accomplish more and achieve higher marks today.

Assignment Writing Service

From complicated assignments to tricky tasks, our experts can tackle virtually any question thrown at them.

Dissertation Writing Service

A dissertation (also known as a thesis or research project) is probably the most important piece of work for any student! From full dissertations to individual chapters, we’re on hand to support you.

Coursework Writing Service

Our expert qualified writers can help you get your coursework right first time, every time.

Dissertation Proposal Service

The first step to completing a dissertation is to create a proposal that talks about what you wish to do. Our experts can design suitable methodologies - perfect to help you get started with a dissertation.

Report Writing
Service

Reports for any audience. Perfectly structured, professionally written, and tailored to suit your exact requirements.

Essay Skeleton Answer Service

If you’re just looking for some help to get started on an essay, our outline service provides you with a perfect essay plan.

Marking & Proofreading Service

Not sure if your work is hitting the mark? Struggling to get feedback from your lecturer? Our premium marking service was created just for you - get the feedback you deserve now.

Exam Revision
Service

Exams can be one of the most stressful experiences you’ll ever have! Revision is key, and we’re here to help. With custom created revision notes and exam answers, you’ll never feel underprepared again.